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【UElandy】多重荧光免疫组化-酪胺信号放大技术
人阅读 发布时间：2023-08-01 13:55
多重荧光免疫组化-酪胺信号放大技术
免疫组织化学（IHC）是一种利用抗原-抗体间的相互作用来显示组织切片中抗原分布和定位的技术。免疫肿瘤学的发展为癌症治疗提供了新的方法，然而，并非所有患者都对免疫治疗有反应。因此，在有限且有价值的患者样本中研究多种治疗靶点和预测性生物标志物制定个性化诊疗方案至关重要。传统的免疫组化技术通常只能完成 1-2 种抗原的染色，多重荧光免疫组化（mIHC）技术的出现突破了传统免疫组化多抗原标记的限制，成为免疫肿瘤学研究的一种极具价值的工具。
多重荧光免疫组化-酪胺信号放大技术(TSA, Tyramide signal amplification)
酪胺信号放大（TSA）是一种基于辣根过氧化物酶（HRP）的催化活性对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。原理为酪胺 Tyramide 的过氧化物酶反应（已标记荧光的酪胺在 HRP 催化 H₂O₂下形成共价键结合位点）产生的大量酶促产物与目标蛋白的酪氨酸残基共价结合，从而使目标蛋白标记上特异的荧光或生物素（BT0075）。多重标记仅需在热修复法去除非共价结合的抗体后换另一种一抗、荧光素酪胺（YT0069, YT0070, YT0071, YT0072, YT0073, YT0074, YT0076），如此往复即可。
图 1. 酪胺信号放大原理 图 2. 荧光标记的酪胺与靶蛋白的酪氨酸残基共价结合
TSA 多标染色技术 VS 传统免疫荧光
| Opal/TSA多标染色技术 | 传统免疫荧光 | |
| 适用范围 | ICC、IHC和原位杂交（FISH）应用中的中低丰度靶标 | ICC、IHC和原位杂交（FISH）应用中的高中丰度靶标 |
| 靶点数目 | 不受限制（最多可同时染色8种） | 一般标记3种 |
| 抗体种类 | 同种属的不同一抗即可，连接辣根过氧化物酶的同种属二抗 | 不同种属的不同一抗，连接荧光探针的不同种属二抗 |
| 染色策略 | 任何样本无需任何染色策略，简单的重复前一步的染色过程，样本/靶点的差异不影响染色过程，操作简单 | 样本抗原的空间位置的差异，需要设计复杂的染色策略。样本/靶点的差异导致染色策略的差异，染色过程复杂、多变 |
| 染色效果 | 高染色分辨率和染色特异性，信号强度强，无背景影响，各靶点的信噪比大大提高，适合组织基于单细胞的定量分析 | 信号强度较弱，各种抗体间存在互相影响，背景较高，对基于单细胞的定量分析不利 |
| 应用范围 | 二抗具备通用性，所有的研究领域均可使用 | 二抗不具备通用性，应用领域受到局限 |
实验流程
产品应用
1. 免疫荧光（石蜡切片）
1. 免疫荧光（石蜡切片）
石蜡组织样本的免疫分析已成为理解肿瘤免疫学复杂性和发现新的癌症免疫治疗预测性生物标志物的关键工具。组织的免疫分析需要评估肿瘤微环境中的组合标志物，包括炎症细胞亚群和免疫检查点。近年来，使用基于酪胺信号放大 (TSA) 技术的多重免疫荧光成为一种可靠的检测方法，能够在一个样本中对多个生物标志物（Y6111, Y6112, Y6113, Y6114, Y6115, Y6116, Y6117, Y6118）进行评估。结合靶向特定的生物标志物，使用该技术可以创建不同的面板（每个面板七个或九个标志物），为癌症研究提供一个全面的系统。
2. 免疫荧光（冰冻切片）
冰冻切片技术在肿瘤病理诊断中应用是最为常见的一种病理学诊断方法，能在较短的时间内借助显微镜对肿瘤性质进行判断，从而确定肿瘤是否存在扩散或者转移等情况，为手术的范围和方法提供强有力的支撑，具有诊断速度快、操作方便快捷等特点，被广泛应用于肿瘤病理诊断中。
图 4. 使用相同宿主的抗体进行三重免疫染色（小鼠下丘脑室旁核切片）【2】。VP（Vasopressin，绿色），CRF（Corticotropin-releasing factor，红色），TH（Tyrosine hydroxylase，黄色），细胞核（蓝色）。
3. FISH
原位杂交是指利用一段特定标记的已知序列作为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，从而对特定核酸序列进行精确定量定位的过程。它能对疾病的病因、特异性诊断、疾病的分型分期、预后的估计、功能-形态的关系以及细胞的分化与增殖的研究提供有价值的信息。传统的 FISH 方法对独特的单拷贝序列进行染色体定位仍然具有挑战性，存在检出率低和重复性差等问题，一种新的方法 TSA-FISH，该方案涉及酶介导的荧光团标记酪胺（YT0069, YT0070, YT0071, YT0072, YT0073, YT0074, YT0076）的沉积，成为单拷贝序列染色体定位的有力工具。
3. FISH
原位杂交是指利用一段特定标记的已知序列作为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，从而对特定核酸序列进行精确定量定位的过程。它能对疾病的病因、特异性诊断、疾病的分型分期、预后的估计、功能-形态的关系以及细胞的分化与增殖的研究提供有价值的信息。传统的 FISH 方法对独特的单拷贝序列进行染色体定位仍然具有挑战性，存在检出率低和重复性差等问题，一种新的方法 TSA-FISH，该方案涉及酶介导的荧光团标记酪胺（YT0069, YT0070, YT0071, YT0072, YT0073, YT0074, YT0076）的沉积，成为单拷贝序列染色体定位的有力工具。
图 5. 苹果蠹蛾（Cydia pomonella）精巢染色体基因定位[3]。染色体用 DAPI（浅蓝色）复染。杂交信号（绿色、红色和紫色）标记了所研究基因(Ace-1、Nan、RpP0和Notch)的物理位置。
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注：可提供 YF/Biotin-Tyramide（YT0069, YT0070, YT0071, YT0072, YT0073, YT0074, YT0076, BT0075）和 1× Tyramide Amplification Buffer（60012）单组分。
本文参考文献（非 UElandy 产品）
[1] Parra E R , Jiang M , Solis L , et al. Procedural Requirements and Recommendations for Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification Assays to Support Translational Oncology Studies[J]. Cancers, 2020, 12(2).
[2] Toth Z E , Mezey E . Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.[J]. Journal of Histochemistry & Cytochemistry Official Journal of the Histochemistry Society, 2007, 55(6):545-54.
[3] Carabajal Paladino L Z , Nguyen P , Šíchová, Jindra, et al. Mapping of single-copy genes by TSA-FISH in the codling moth, Cydia pomonella[J]. BMC Genetics, 2014, 15.
本文参考文献（非 UElandy 产品）
[1] Parra E R , Jiang M , Solis L , et al. Procedural Requirements and Recommendations for Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification Assays to Support Translational Oncology Studies[J]. Cancers, 2020, 12(2).
[2] Toth Z E , Mezey E . Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.[J]. Journal of Histochemistry & Cytochemistry Official Journal of the Histochemistry Society, 2007, 55(6):545-54.
[3] Carabajal Paladino L Z , Nguyen P , Šíchová, Jindra, et al. Mapping of single-copy genes by TSA-FISH in the codling moth, Cydia pomonella[J]. BMC Genetics, 2014, 15.
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